Hva er de forskjellige metoder for Protein Konsentrasjon Fastsettelse?

October 23  by Eliza

Det finnes hundrevis av forskjellige metoder for proteinkonsentrasjonen besluttsomhet. Den utrolige mangfold i typer proteinløsninger som biokjemikere analyserer er hvorfor det er ingen enkel universell metode som fungerer for hver type protein løsning. De mest vanlige proteinanalyser er Bradford assay Lowry-analysen og bicinchoninic syreanalyse. Likevel har utallige variasjoner blitt utviklet som er nødvendig for å omgå eventuelle kjemiske uforenlighet mellom proteinoppløsningen og reagensene som blir anvendt i analysen.

Generelt sett er det to hovedkategorier av analyser for proteinkonsentrasjonen besluttsomhet. I den første gruppe av metoder, er et fargerikt eller fluorescerende fargestoff tilsatt til en proteinløsning, og det binder spesifikt til protein. Den bundne fargestoff har en unik absorpsjonsbølgelengde som er proporsjonal med mengden av protein. Ved å bruke et spektrometer, blir det mulig å beregne konsentrasjonen av protein.

Den andre gruppen av analyser involverer tilsetning av kobber (II) -ioner til en oppløsning av protein, hvor disse ioner reduseres til kobber (I) ioner. Disse reduserte ioner er da i stand til å danne fargerike komplekser ved å binde seg til proteiner. Ved å måle absorbansen ved sine unike bølgelengder, kan de proteinkonsentrasjoner på samme måte kunne utledes.

En av de mest populære metoder for proteinkonsentrasjonsbestemmelse er Bradford assay. I dette assay, et rødt fargestoff som kalles Coomassie Brilliant blått ble tilsatt til en proteinoppløsning under sure betingelser. Ettersom dette fargestoff bindes til protein, det danner en permanent blå kompleks med en karakteristisk absorpsjon ved 595 nanometer.

Til tross for den generelle anvendelighet av Bradford-analysen, er det kompatibelt med noen proteinløsninger. Spesielt er det Bradford assay forstyrret ved tilstedeværelse av natriumdodecylsulfat (SDS), en detergent som er vanlig brukt for å rense proteiner og bryte ned cellene ved lysis. Dette vaskemiddel interfererer med binding av farvestoffet til proteiner, hvilket resulterer i en upålitelig og feilaktig absorpsjon lesing. Andre typer metoder, da, må brukes når SDS er til stede.

En annen serie av proteinanalyser har blitt utviklet, og de alle innebære en variasjon av Biuret testen. I denne reaksjon, er et protein som kombinert med en vandig base og kobber (II) -ioner. Disse ionene reduseres og deretter kjelatert av protein for å danne fargerike komplekser. To analyser som bruker denne testen er Lowry-analysen og bicinchoninic syreanalyse.

Med Lowry-analysen, er et Folin-Ciocalteu-reagens tilsatt til Biuret testen. Den Folin-Ciocalteu-reagens oksyderer aromatiske rester, spesielt tryptofan, og bidrar til den komplekse absorberer sterkt ved 750 nm. Den bicinchoninic syre-analyse, på den annen side, medfører tilsetning av syre til bicinchoninic Biuret testen. Etter en kort inkubasjon ved omtrent 104 ° F (40 ° C), to ekvivalenter syre og peptidbindinger i proteinet chelat en enkelt kobber (I) -ionet. Resultatet er et kompleks som absorberer sterkt ved 562 nm.

Ved valg av en fremgangsmåte for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen, er det viktig for en å vurdere de forskjellige kjemiske funksjonelle grupper som er tilstede i løsningen. Tilstedeværelsen av visse aminosyresidekjeder, disulfidbindinger og kofaktorer kan gjøre proteinkonsentrasjonsbestemmelse vill unøyaktig. Det er ofte nødvendig for en å vurdere ikke bare proteiner, men også andre reagenser og buffere, såsom reduksjonsmidler og vaskemidler. Den ideelle metoden vil være kjemisk kompatibel samt være pålitelig, billig og enkel å sette opp.

  • I en fremgangsmåte for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen, et fargestoff som binder seg til protein tilsettes til en proteinoppløsning.