Hva er Shotgun Sekvense?

November 2  by Eliza

Shotgun-sekvensering er en fremgangsmåte for DNA-sekvensering, hvorved en lang strekning av DNA er fysisk brytes opp i små (ca. 2000 basepar) fragmenter som er klonet, sekvensert, og montert ved hjelp av datamaskinanalyse. Det ble utviklet og gjort kjent av Craig Venter av Celera Corporation. Venter utviklet teknikken i 1996 mens han jobbet ved Institutt for Genome Research.

Venter stiftet Celera i 1998 med oppdrag å sekvensere det menneskelige genom innen tre år. Dette målet var i direkte konkurranse med allerede opererer Human Genome Project, et konsortium av universiteter som arbeider sammen for å sekvensere det menneskelige genom bruker en eldre strategi kalt kartbasert eller BAC-til-BAC sekvensering. Denne metoden involvert først bryte genomet til 150.000 basepar biter som kalles BACS, montering av BACS i orden, og deretter sekvense hver BAC i detalj.

Hele genomet hagle sekvense forbigår skapelsen og kartlegging av BACS og starter rett på med DNA-sekvensering. Prosessen starter med å skaffe en prøve av høy molekylvekt-DNA fra organismen av interesse og fysisk å bryte det opp i små biter ved å føre det gjennom en smal sporvidde sprøyte eller sonicating den, en måte å bryte prøven ved hjelp av lydbølger. Skråstilling er en tilfeldig prosess, slik at sekvensene til fragmentene vil ha en viss overlapping mellom dem. Shearing ikke spesifikt skape de 2000 basepar-fragmenter som er nødvendige for sekvensering, snarere fragmenter av den ønskede størrelse må renses fra blandingen.

Det neste trinnet er å delta i DNA-fragmenter med transportøren DNA kalles en vektor. Denne prosessen er kjent som kloning, og det skaper en sekvense bibliotek hvorfra sekvensen av hele genomet blir opprettet. Sekvensen til hver klon i biblioteket bestemmes, og dataanalyse blir brukt til å finne overlappende, eller kontinuerlige sekvenser i hvert fragment. Montering av overlappinger skaper en "contig", som er en lang sammenhengende strekning av DNA-sekvensen.

Hagle kloning vil vanligvis resultere i noen hull mellom contigs fordi noen sekvenser mangler fra biblioteket ved en tilfeldighet. Hullene kan fylles ved å lage et nytt bibliotek eller ved å bruke kjente sekvenser å utvide utover fra contig. Fordi hagle sekvense sekvenser DNA-fragmenter på måfå, er mange fragmenter sekvensert mer enn en gang, skape større sikkerhet for at sekvensen er riktig enn om hvert fragment hadde bare blitt sekvensert en eller to ganger.

Det menneskelige genom sekvensert både av Human Genome Project ved bruk av kart-basert sekvensering og ved Celera hjelp hagle sekvensering. Shotgun-sekvensering er nå den foretrukne metode for andre typer av genom-sekvensering. De fullstendige genom av mange organismer, slik som planten Arabidopsis thaliana, ris, ku, hund, kylling, sjimpanse, rotte, mus, pufferfish, og mange mikroorganismer har blitt sekvensert på denne måten.

  • En lang DNA-sekvens blir brutt opp i små stykker i hagle-sekvensering.
  • Shotgun-sekvensering er nå den foretrukne metode for mange typer av genom-sekvensering.