Hva er Western Blot-protokollen?

November 21  by Eliza

Western blot-protokollen er de nøyaktige standarder som immunoavtrykket testen er gjennomført. Western blot benyttes til å påvise proteiner i en vevsprøve. Prosessen skiller native proteiner ved å bestemme lengden av polypeptider ved hjelp av en gel-elektroforese. De proteiner i seg selv blir deretter overført til en nitrocellulosemembran og probet med antistoffer.

Den første delen av western blot-protokollen begynner med vev samling. Disse prøver er samlet enten fra levende vev eller fra en cellekultur. Vevet brytes ned og forskjellige inhibitorer slik som protease eller fosfatase er innført for å hindre enzymene i å utføre fordøyelsen. Denne del av protokollen blir vanligvis behandlet ved lave temperaturer for å bevare vev.

Gel elektroforese prosessen er det neste trinnet i western blot protokollen. I denne del, er proteinene identifisert av forskjellige faktorer, slik som molekylvekt eller elektrisk ladning. Denne prosessen er vanligvis fullført ved hjelp av polyakrylamid-geler med en buffer av natriumdodecylsulfat. I utgangspunktet, proteinene blir negativt ladet og bevege seg mot en positivt ladet elektrode i gelen.

Overføring av proteinene er den neste del av den totale western blot prosessen. En membran er plassert på toppen av gelen, etterfulgt av filterpapir. Som en elektrisk strøm blir administrert, blir proteiner som trekkes inn i membranen. Dette er referert til som selve "blotting" delen av analysen. Membranene er meget skjøre og lett utsatt for skader.

Den riktige strømning av western blot-skriftene krever trinnet er kjent som binding. For å hindre forurensning av proteiner i seg selv av antistoffene som skal tilsettes, en slags skjerming må iverksettes. Den vanligste form for blokkering bruker ikke-fet tørrmelk og en detergent. Dette binder seg til de åpne plassene i membranen og gir klarere resultater når antistoff tilsatt.

Detection er neste trinn i henhold til korrekt protokoll. Proteinene blir introdusert til antistoffer som er knyttet til et bestemt enzym som vil gi forskerne ønsket informasjon. Antistoffet blir inkubert med membranen i 30 minutter eller mer. Etterpå blir membranen vasket og et sekundært antistoff innføres som binder seg til det første. Ofte er et luminescerende middel som anvendes for å bistå forskere med identifiseringsprosessen.

Materialet vaskes igjen for å fjerne eventuelle ikke-bundne elementer. Analyse av størrelsen av de fargede båndene viser informasjon angående betydning og utstrekningen av et bestemt protein. Dette er vanligvis fullført et par ganger for å sikre av riktig analyse. Alternativer for påvisning inkluderer x-stråler, farging og kjemikalier.